Grasgarnalen is een belangrijke economische soort in de zoetwateraquacultuurindustrie van China. In de afgelopen jaren echter deHepatopancreas Microsporidium(EHP), een parasiet die de hepatopancreas van de garnalen infecteert, heeft de industrie ernstig beïnvloed. Aangezien er momenteel geen effectief medicijn of vaccin is om deze ziekte te behandelen, is snelle en nauwkeurige detectie cruciaal om de verspreiding ervan te voorkomen.
A.Magnified 9. 0 × 1 0 3 keer; B. 5,0 × 104 keer vergroot.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang GE, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Isolatie en morfologische observatie van hepatopancreatische microsporidium in litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences of China, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Detectie van EHP is voornamelijk gebaseerd op moleculaire biologiemethoden, waarbij PCR -technologie het meest voorkomt. Hoewel PCR een hoge gevoeligheid biedt, vereist het echter dure PCR -apparatuur en een gespecialiseerde laboratoriumomgeving, waardoor het ongeschikt is voor veldgebruik. Om dit probleem aan te pakken, ontwikkelde het onderzoeksteam twee snelle detectiemethoden op basis van MiRA -technologie. Deze methoden bieden een hoge gevoeligheid, snelle respons en eenvoudige werking, waardoor een efficiënte en snelle detectie van EHP in garnalen ter plaatse mogelijk is zonder de noodzaak van complexe laboratoriumapparatuur, waardoor de kloof in de huidige detectiemethoden wordt gevuld.
Amplificatiereagentia die in de studie worden gebruikt:
- DNA -isotherm Rapid Amplification Kit (Basic)
- DNA -isotherme snelle amplificatiekit (colloïdaal gouden striptype)
MiRA-technologie is een multi-enzym isothermische snelle nucleïnezuuramplificatiemethode. Het kernprincipe omvat de gecoördineerde werking van meerdere functionele eiwitten bij omgevingstemperaturen om snelle nucleïnezuuramplificatie te bereiken, waardoor echt draagbare, op locatie nucleïnezuurdetectie mogelijk wordt.
Onderzoeksmethoden
Monster -extractie
Het onderzoeksteam verzamelde zowel geïnfecteerde als gezonde grasgarnalenmonsters van drie garnalenboerderijen in de provincie Liaoning en haalde DNA uit de hepatopancreas van de garnalen.
Primerontwerp
Drie sets van MiRA -primers werden ontworpen op het S8 -serine -eiwitgen van EHP (GenBank -toegangsnummer: op 182063). Dit gen heeft unieke actieve sites en zorgt voor de specificiteit van detectie.
Mira-leeftijd en Mira-LFD-detectie
(A) Geoptimaliseerde RPA-leeftijd reactietemperaturen. M: DL 500 marker; N: negatieve controle; Stammen 1-5: 25 graden, 30 graden, 37 graden, 39 graden en 42 graden.
(B) Geoptimaliseerde RPA-leeftijd reactietijden. M: DL 500 marker; N: negatieve controle; 1: 10 min; 2: 20 min; 3: 30 min; 4: 40 min.
(C) Geoptimaliseerde RPA-LFD-reactietemperaturen. N: negatieve controle; 1: 25 graden; 2: 30 graden; 3: 37 graden; 4: 39 graden; 5: 42 graden.
(D) Geoptimaliseerde RPA-LFD-reactietijden. N: negatieve controle; 1: 5 min; 2: 10 min; 3: 20 min.
De twee MIRA-detectiemethoden, MiRA-leeftijd (agarosegelelektroforese) en MiRA-LFD (colloïdale gouden laterale stroom immunoassay), werden gebruikt om EHP te detecteren. Het onderzoeksteam heeft de reactietemperaturen en -tijden door experimenten geoptimaliseerd. MiRA-leeftijd versterkte het doel-DNA in 30 minuten na 37 graden, terwijl MiRA-LFD in slechts 10 minuten na 37 graden de resultaten voltooide, met de resultaten binnen 5 minuten leesbaar.
Experimentele resultaten
Specificiteit en gevoeligheid
(A) Specificiteit van RPA-leeftijd detectie. M: DL 1000 marker; P: Nosema Bombycis; 1: EHP; 2: Encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: White Spot Syndrome Virus; 6: Abnormaal; N: Negatieve controle.
(B) Specificiteit van RPA-LFD-detectie. P: Nosema Bombycis; N: negatieve controle; 1: EHP; 2: Encefalitozoon; 3: Microsporidia; 4: White Spot Syndrome Virus; 6: Abnormaal.
(C) Gevoeligheid van RPA-leeftijd met gradiëntverdunningen van recombinante plasmiden. M: DL 500 marker; N: negatieve controle; 1: 4,7 × 10^5 kopieën/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopieën/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopieën/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopieën/µl; 5: 4.7 kopieën/µl; 6: 4.7 Kopieën/µl.
(D) Gevoeligheid van RPA-LFD met gradiëntverdunningen van recombinante plasmiden. N: negatieve controle; 1: 4,7 × 10^5 kopieën/µl; 2: 4,7 × 10^4 kopieën/µl; 3: 4,7 × 10^3 kopieën/µl; 4: 4,7 × 10^2 kopieën/µl; 5: 4.7 kopieën/µl; en 6: 4.7 kopieën/µl.
De experimenten toonden aan dat MiRA -technologie een hoge specificiteit heeft, waarbij EHP nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder te reageren op andere ziekteverwekkers. In termen van gevoeligheid hadden beide methoden een detectielimiet van 4,7 kopieën/µL, aanzienlijk hoger dan de gevoeligheid van traditionele PCR.
Klinische monstertests
Resultaten van het testen van 30 klinische monsters toonden aan dat MiRA-leeftijd en MiRA-LFD een positiviteitspercentage van 70%hadden, iets lager dan 80%van QPCR maar aanzienlijk hoger dan de traditionele PCR's 56,7%.
Toepassingsperspectieven
Op MiRA gebaseerde detectiemethoden zorgen voor snelle amplificatie van doelgenen bij constante temperaturen. In het bijzonder kan de MIRA-LFD-methode resultaten opleveren in slechts 10 minuten zonder dat complexe laboratoriumapparatuur nodig is, waardoor het ideaal is voor gebruik ter plaatse in garnalenboerderijen. De hoge gevoeligheid en specificiteit van deze technologie maken het een efficiënt hulpmiddel voor vroege detectie en controle van EHP, waardoor de gezondheid en ontwikkeling van de grasgarnalen landbouwindustrie wordt beschermd.
Onder deze methoden is de colloïdale gouden laterale stroming-immunoassay (MIRA-LFD) bijzonder goed geschikt voor toepassingen ter plaatse vanwege zijn eenvoud en intuïtieve resultaten. Gras garnalenboeren kunnen snel EHP -infecties detecteren en reageren, waardoor de mogelijkheden voor ziektebestrijding worden verbeterd, de efficiëntie van de landbouw aanzienlijk stimuleren en de economische verliezen verminderen.