Hier creëren we sCRAM (suboptimaal protospacer aangrenzend motief (PAM)-gemedieerde CRISPR RNA en Cas12a-nuclease gecombineerd met multi-enzym isothermische snelle amplificatie), een snel en extractie-vrij diagnostisch platform dat ASFV binnen 20 minuten detecteert. sCRAM integreert een snelle nucleïnezuurafgiftestap (40 graden, 5 min) met een één-buisreactie die multi-enzym isothermische amplificatie (MIRA) combineert met een suboptimale PAM-gemedieerde CRISPR/
Cas12a-systeem (37 graden, 15 min), waardoor instrument-vrije visuele uitlezing mogelijk is via UV-licht of laterale flowstrips (LFS).sCRAM demonstreert de detectiegevoeligheid voor enkele- kopieën en vertoont geen kruis-reactiviteit met vijf veel voorkomende varkenspathogenen (PRRSV, PPV, JEV, PCV en PRV). De evaluatie van 111 gesimuleerde en klinische monsters (inclusief bloed, plasma en uitstrijkjes) onthulde een overeenstemming van 100% met qPCR voor UV-uitlezing en 98,20% voor LFS
uitlezing, waarbij beide methoden 100% specificiteit vertonen. De eenvoud, snelheid en het aanpassingsvermogen van sCRAM onderstrepen het potentieel ervan voor gedecentraliseerde ASFV-surveillance in omgevingen met beperkte middelen, en bieden een krachtig hulpmiddel voor het indammen van uitbraken.
In deze studie hebben we sCRAM ontwikkeld, een snel en veld-inzetbaar ASFV-detectieplatform dat suboptimale PAM-gemedieerde CRISPR/Cas12a integreert met multi-enzym isotherme amplificatie. De test bereikt binnen 20 minuten een gevoeligheid van één-kopie 1 kopie/uL en vertoont geen kruis-reactiviteit met belangrijke varkenspathogenen. Klinische validatie van bloed-, plasma- en uitstrijkjesmonsters toonde volledige overeenstemming aan met qPCR met behulp van UV-lichtuitlezing en 98,20% nauwkeurigheid via laterale flowstrips. Met vereenvoudigde bediening, hoge gevoeligheid en specificiteit, en visuele resultaatinterpretatie biedt sCRAM een groot potentieel voor lokale ASFV-bewaking op locatie en bredere diagnostische zorgtoepassingen.
