Aeromonas hydrophila is een belangrijke pathogene bacterie in de aquacultuur, die ernstige ziekten veroorzaakt bij landbouwhuisdieren en aanzienlijke economische verliezen tot gevolg heeft. Om snelle detectie ter plaatse- mogelijk te maken, hebben we een draagbaar microfluïdisch platform ontwikkeld dat multi-enzyme isothermische snelle amplificatie (MIRA) integreert met geautomatiseerde vloeistofbehandeling. Het chipontwerp omvatte een miniatuur vibratiemotor en keramische verwarmingskussens om te onderhouden
nauwkeurige temperatuurregeling en waarborging van de homogeniteit van de reactie tijdens de extractie en amplificatie van nucleïnezuren. Een miniatuurluchtpomp dreef het ruwe DNA-extract in één enkele pipetteerstap door de chip voor nauwkeurigheidkwantificering. Het geëxtraheerde DNA werd vervolgens overgebracht naar een reactiekamer die vooraf was geladen met MIRAreagentia voor isotherme amplificatie bij 39 graden onder realtime fluorescentiemonitoring. Dit platform gedetecteerd
A. hydrophila in watermonsters binnen 40 minuten, waarbij een lineair bereik wordt bereikt van 1 × 10² tot 1 × 10⁷ CFU⋅mL−1en een detectielimiet (LOD) van 10 CFU⋅mL−1. Met name het modulaire ontwerp maakt een gemakkelijke uitwisseling van primers en probes mogelijk, waardoor het platform gemakkelijk aanpasbaar is voor het detecteren van diverse bacteriële pathogenen in de aquacultuur.
Schematische vergelijking van het draagbare microfluïdische platform en het conventionele detectieplatform voor A. hydrophila. (A) De draagbare microfluïdische
platform. De detectieworkflow op dit platform integreert nucleïnezuurextractie, nauwkeurig pipetteren, amplificatie en detectie. (B) Het conventionele detectieplatform. De conventionele laboratorium-gebaseerde workflow is afhankelijk van geavanceerde apparatuur, opgeleid personeel en tijd-intensieve procedures.
Stabiliteitsbeoordeling van het draagbare microfluïdische platform. (A) Foto van het draagbare microfluïdische platform. (B, C) Thermische prestaties van de nucleïnezuurextractie- en detectiekamers. Verband tussen keramisch verwarmingskussen en kamertemperatuur. (D) Stabiliteit van fluorescentiedetectie (N=3). De fluorescentie-intensiteit werd tijdens het amplificatieproces met tussenpozen van 5 minuten gemeten.
Prestatie-evaluatie van het draagbare microfluïdische platform. (A) Kalibratiecurve voor detectie van A. hydrophila (N=3). Er werd een kalibratiecurve opgesteld door A. hydrophila te detecteren over een concentratiebereik van 1 × 101 –1 × 108 CFU⋅mL−1onder optimale omstandigheden. (B) Beoordeling van de reproduceerbaarheid van chips-tot-chips. De MIRA-test voor A. hydrophila werd uitgevoerd op tien chips vervaardigd uit elk van de twee onafhankelijke mallen. (C) Specificiteitsanalyse (N=3). De specificiteit van de MIRA-test werd gevalideerd tegen de doelsoort A. hydrophila en 11 niet-doelbacteriesoorten. (D) Vergelijking met qPCR (N=3). Zowel het platform als de qPCR werden gebruikt om A. hydrophila in verschillende concentraties te detecteren. (E) Detectie van veld-geïsoleerde stammen (N=3). Er werden vier veld-geïsoleerde stammen van A. hydrophila gedetecteerd met behulp van zowel het platform als de qPCR.