Om signaalamplificatie voor sporenhoeveelheden virale nucleïnezuren te bereiken en voldoende substraten voor Cas14a te bieden, hebben we aMIRA (asymmetrische multi-enzym isothermische snelle amplificatie) ontwikkeld op basis van MIRA. Het resulterende aMIRA-Cas14a-systeem biedt de volgende belangrijke voordelen:
1. Dankzij de geoptimaliseerde primer-stoichiometrie kan MIRA bij voorkeur ssDNA overproduceren, dat dient als het directe substraat voor Cas14a. Door de voorwaartse-naar-reverse primerverhouding aan te passen naar 20:1, genereert het systeem voldoende ssDNA om de PAM-onafhankelijke splitsingsactiviteit van Cas14a te activeren, die specifiek ssDNA herkent en splitst.
2. Eén-pot-integratie van MIRA en CRISPR-Cas14a elimineert kruisbesmettingsrisico's.
3. MIRA verbetert de detectiegevoeligheid aanzienlijk, waardoor de detectie van virale nucleïnezuren met een ultralage concentratie mogelijk wordt.
4. aMIRA-Cas14a behoudt een hoge specificiteit en vermijdt valse positieven veroorzaakt door niet-specifieke amplificatie.
Uiteindelijk elimineert de éénpotige integratie van MIRA en CRISPR-Cas14a besmettingsrisico's en bereikt een perfecte synergie tussen de sterke punten van MIRA en het CRISPR-Cas14a-systeem. Dit lost het sectorbrede probleem van de incompatibiliteit tussen isothermische versterking en CRISPR-systemen op, wat de belangrijkste technologische doorbraak van het MaC14a-platform vertegenwoordigt. Het aMIRA-Cas14a-systeem bereikt een duizendvoudige verbetering in gevoeligheid en zorgt tegelijkertijd voor specifieke versterking. Gecombineerd met de sequentiespecifieke herkenning van Cas14a zorgt dit voor tweelaagse specificiteitsvalidatie, zonder kruisreactiviteit tegen niet-doelvirussen of gezonde monsters-wat een ander pijnpunt in de sector aanpakt: de neiging tot valse positieven.
De MIRA multi-enzym isothermische snelle amplificatiereagentia die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn geleverd door Amp-Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Naast uitstekende reagensprestaties biedt Amp-future Biotech ook een professioneel en snel reagerend technisch ondersteuningsteam.
MIRA demonstreert een sterke compatibiliteit met op centrifuges-gebaseerde microfluïdische chips die zijn ontwikkeld voor onderzoeks- en diagnostische toepassingen:
1. Geminiaturiseerd reactiesysteem, geschikt voor de reactiekamers met micro-volume die kenmerkend zijn voor microfluïdische chips;
2. Multiplex-detectiemogelijkheid in één keer;
3.Compatibiliteit met draagbare apparaten, soepele workflows van monster tot resultaat.
we hebben een geïntegreerd draagbaar 'sample-in, antwoord-out' point-of-care test-apparaat (POCT) ontwikkeld, geoptimaliseerd voor gebruik in het veld, zoals geïllustreerd in afbeelding. 4A. Het compacte prototype (23 cm (L) × 21 cm (B) × 14 cm (H), 12,5 kg totale massa) bereikt een uitzonderlijke draagbaarheid. De kerncomponenten van het systeem omvatten een zeer nauwkeurige servomotor voor nauwkeurige rotatiecontrole en een luchtverwarmingseenheid voor temperatuurregeling. Een geïntegreerde optische detectiemodule, geplaatst onder de chip, vergemakkelijkt de fluorescentie-excitatie en -meting, waardoor een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid bij de detectie wordt gegarandeerd. Het draagbare apparaat is uitgerust met een ingebed Android-besturingssysteem, dat een gebruiksvriendelijke interface- biedt waarin operators voorgeprogrammeerde bedieningsbestanden kunnen selecteren met gedetailleerde parameters zoals reactietijd en temperatuur. Resultaten en conclusies worden in realtime-op een LCD-scherm weergegeven, waardoor snelle informatieverwerving mogelijk is. Bovendien bevat het systeem een draadloze communicatiemodule die realtime-gegevensoverdracht naar mobiele apparaten of cloudservers ondersteunt, en integreert met kunstmatige intelligentie-algoritmen voor onmiddellijke interpretatie en analyse van testresultaten.
