Moleculaire diagnostische technologieën evolueren tegenwoordig in een ongekend tempo, met aanzienlijke vooruitgang in de afgelopen twee jaar. Onder hen hebben isothermische amplificatietechnologieën meer aandacht gekregen vanwege hun vermogen om versterking uit te voeren zonder gespecialiseerde apparatuur. Er bestaan verschillende bekende isothermische versterkingsmethoden, zoals lamp, RPA en RAA. Vandaag wil ik echter een nieuwere isothermische versterkingstechnologie-mira introduceren.
Om ervoor te zorgen dat iedereen een consistent begrip heeft van de belangrijkste concepten, zijn hier enkele term uitleg:
- Recombinase polymerase-amplificatie (RPA): dit is een door recombinase gemedieerde amplificatietechnologie.
-Recombinase-ondersteunde amplificatie (RAA): een vergelijkbare door recombinase gemedieerde amplificatiemethode.
- Loop-gemedieerde isothermische amplificatie (LAMP): een andere isothermische amplificatietechniek.
- Multienzyme isotherm Rapidamplificatie (MiRA): een nieuwe isothermische snelle versterkingstechnologie.
Snelle samenvatting en verduidelijking:
Velen vragen zich misschien af welke van deze verschillende isothermische versterkingsmethoden betrouwbaarder en stabieler is. In werkelijkheid heeft elke technologie zijn sterke punten en beperkingen. De belangrijkste factoren voor succesvolle acceptatie zijn echter de mogelijkheid om de productie betrouwbaar, lage kosten en robuuste prestaties in verschillende toepassingen op te schalen.
Ik zal nu elke technologie kort analyseren op basis van wat ik weet:
Lamp (lus-gemedieerde isotherme versterking):
Velen in het veld weten dat lamp is ontstaan in Japan, ontwikkeld door Dr. Notomi in 2000 als een nieuwe genamplificatietechniek. Momenteel is het eigendom van deze technologie van het Japanse bedrijf Eiken Chemical Co., Ltd.
Voordelen:
- Hoge gevoeligheid (2-5 Orders van grootte hoger dan traditionele PCR -methoden).
- Korte reactietijd (reacties kunnen worden voltooid in 30-60 minuten).
- Geen speciale instrumenten nodig bij klinisch gebruik (hoewel een realtime turbidimeter wordt aanbevolen tijdens de ontwikkeling van kit).
- Gemakkelijk te bedienen (of het nu DNA of RNA detecteert, het proces omvat het mengen van de reactieoplossing, enzymen en sjabloon in een reactiebuis en vervolgens incuberen na ongeveer 63 graden voor 30-60 minuten in een waterbad of incubator, met resultaten waarneembaar door het naakte oog).
Nadelen:
- Hoge gevoeligheid kan leiden tot aerosolbesmetting zodra de buis is geopend, waardoor deze ongeschikt is voor gebruik buiten een PCR -laboratorium vanwege een hoog risico op valse positieven.
- Primer -ontwerp is een uitdaging, waardoor het ongeschikt is voor sommige ziekten, vooral die veroorzaakt door virussen met weinig gemeenschappelijke sequenties.
- De toepassing ervan is relatief beperkt.
RPA- en RAA -isothermische versterkingstechnologieën:
Deze twee methoden zijn grotendeels homoloog, met als belangrijkste verschil de bron van het gebruikte recombinase.
- RPA's recombinase komt van de T4 -bacteriofaag.
- RAA's recombinase is afgeleid van bacteriën of schimmels.
Belangrijkste punten van het werkprincipe:
1. In aanwezigheid van ATP bindt het recombinase aan primers en vormt het een eiwit-nucleïnezuurcomplex, dat vervolgens op zoek is naar bijpassend doel-DNA.
2. Zodra de primer de bijpassende DNA -sjabloon vindt, biedt ATP -hydrolyse de energie voor recombinase om de primer te verlaten en DNA -polymerase synthetiseert een nieuwe DNA -streng.
3. Tegelijkertijd binden enkelstrengige DNA-bindende eiwitten (SSB) aan de verplaatste DNA-streng om hervorming van de dubbele streng te voorkomen.
Voordelen:
- De RPA/RAA -reactie is zeer snel, met resultaten haalbaar in ongeveer 30 minuten.
- Gevoeligheid kan 10 kopieën/μl bereiken.
- Geen behoefte aan complexe apparatuur tijdens versterking.
-Verdere ontwikkeling van op sonde gebaseerde of colloïdale goudchromatografiemethoden vereenvoudigt de interpretatie van het resultaat aanzienlijk, waardoor ze goed geschikt zijn voor gebruik in resource-beperkte of economisch achtergestelde gebieden.
Nadelen:
- RPA is een technologie die is ontwikkeld door het Britse bedrijf Twistdx, dat nu eigendom is van Abbott, wat resulteert in hoge kosten, lange voedingscycli en gebrek aan technische ondersteuning. Dit maakt grootschalige toepassing en massaproductie moeilijk in China.
- RAA is een puur binnenlandse technologie, maar het mist stabiliteit in termen van interferentieweerstand en consistentie van productreagens. Bovendien heeft het productieproces voor functionele enzymen verbetering nodig. Hoewel de technologie al vijf jaar op de markt is, is deze nog niet op grote schaal aangenomen vanwege problemen met stabiliteit en veelzijdigheid.
- Zowel RPA als RAA vereisen primers die 30-35 bp lang zijn. Kortere primers beïnvloeden specificiteit, gevoeligheid en versterkingssnelheid, waardoor primerontwerp uitdagend is.
Mira (multienzym isotherm Rapid -amplificatie):
Mira is een nieuwe isothermische amplificatietechnologie geïntroduceerd in half -2019. Het is homoloog voor RPA en RAA.
Hoewel Mira overeenkomsten deelt met RPA en RAA in termen van werkprincipes, zijn er significante verschillen in selectie, teelt, teelt, zuivering en andere aspecten van grootschalige productie. Bovendien heeft het technische team achter Mira's ontwikkelaar, Ampfuture, bijna 11 jaar besteed aan het perfectioneren van de technologie. Het is nu volledig uitgerust om de ontwikkeling van kant-en-klare reagentia, aangepaste ontwikkeling, onderzoeksprojecten en andere aanpasbare diensten te ondersteunen.
Voordelen:
1. De functionele eiwitten in Mira -reagentia zijn afkomstig van verschillende enzymen, waarbij sommige enzymen gerichte modificaties ondergaan om de efficiëntie van het kern enzymsysteem te verbeteren, wat resulteert in een meer uitgebreid systeem.
2. Sterke interferentieweerstand en stabiliteit. De MIRA-reagentia ondergaan een uitgebreide optimalisatie in termen van cofactorselectie en concentratie, samen met vriesdrogende productieprocessen, waardoor ze beter bestand zijn tegen interferentie en stabieler.
3. Aanpassing en veelzijdigheid. Vanwege volledige controle over de productie van functionele eiwitten en een diep begrip van de technologie, kan MiRA worden aangepast aan verschillende applicaties, die verschillende reagensystemen en gepersonaliseerde aanpassingsdiensten aanbieden.
4. Proprietaire octrooien. Aangezien Mira 100% in eigen land is ontwikkeld, bestaat er geen risico op inbreuk op octrooien tijdens productontwikkeling. Dit geeft Mira een concurrentievoordeel, zowel op de binnenlandse als op de internationale markten.
5. Er is een compleet productieprotocol vastgesteld, waardoor een stabiele grootschalige productie mogelijk is.
Nadelen:
1.. Marktherkenning is nog steeds laag, en meer gegevens en referenties uit verschillende gebieden (zoals positieve tarieven in verschillende gebieden) zijn nodig om een bredere acceptatie te krijgen.
2. Primerontwerp volgt nog steeds de kenmerken van RPA of RAA, waarvoor langere primer- of sonde -sequenties nodig zijn, die mogelijk geen snelle schakelaar voor huidige PCR -gebruikers vergemakkelijken.