Afstembare controle van Cas12-activiteit bevordert universele en snelle detectie van nucleïnezuren in één- pot
Uitgegeven door: Universiteit voor Wetenschap en Technologie van China
Tijdschrift: Natuurcommunicatie
Impactfactor: 14,7
Met behulp van MIRA-technologie werd een universele één-pot fluorescente nucleïnezuurdetectiemethode (SURVEY) ontwikkeld, gebaseerd op natriumheparine. Studies hebben aangetoond dat natriumheparine de Cas12a-splitsingsactiviteit kan reguleren door het Cas12a-crRNA-bindingsproces te verstoren. Door de natriumheparineconcentratie aan te passen, is SURVEY compatibel met zowel klassieke als suboptimale PAM-sequenties en toepasbaar op meerdere Cas12-subtypen. Deze methode, met een detectietijd van slechts 15-20 minuten, bereikt een gevoeligheid en specificiteit van meer dan 95% voor het detecteren van het apenpokkenpseudovirus, het influenza A-virus en SARS-CoV-2. Het is goedkoop-en biedt een nieuwe point-of-care-detectiemethode voor medische velddiagnose en omgevingsmonitoring, waarmee het moeilijke evenwicht tussen gevoeligheid en specificiteit in traditionele CRISPR-diagnostiek wordt aangepakt.
1. Onderzoek naar het werkingsmechanisme van heparinenatrium
Er werd een fluorescerende probe toegevoegd aan het Cas12a-crRNA-systeem dat 10 nM doel-DNA bevatte, en er werd een snel en significant fluorescentiesignaal waargenomen zonder de toevoeging van natriumheparine. Toen 0,2 ug/ml natriumheparine werd toegevoegd, was het fluorescentiesignaal vergelijkbaar met dat van de controlegroep, wat aangeeft dat natriumheparine de trans--splitsingsactiviteit van Cas12a sterk remde. . 0.2ug/ml natriumheparine is de minimale remmende concentratie. Naarmate de concentratie natriumheparine stijgt van 0,2 µg/ml naar 0,5 µg/ml, wordt de cis--splitsingsactiviteit van Cas12a geleidelijk geremd, en bij 0,5 µg/ml wordt de trans--splitsingsactiviteit bijna volledig geremd. Onderzoek naar het werkingsmechanisme van natriumheparine heeft aangetoond dat de negatief geladen groepen natriumheparine de correcte binding van crRNA aan Cas12a verstoren en de vorming van het binaire crRNACas12a-complex kunnen beïnvloeden.
- MIRA-Cas12a één-potdetectie
Na het valideren van het werkingsmechanisme van natriumheparine, onderzocht het artikel een detectiestrategie met één pot (MIRA-Cas12a), waarbij MIRA-amplificatie en Cas12a-gemedieerde fluorescentiedetectie in één buisje werden gecombineerd.
Bij afwezigheid van natriumheparine produceerde de MIRA-Cas12a-combinatie geen significant fluorescentiesignaal binnen het doelgenconcentratiebereik van 0,1aM tot 10fM. Bij 40 µg/ml natriumheparine werd een significant fluorescentiesignaal waargenomen over het doelconcentratiebereik van 1aM (≈0,6 kopieën/μl, volume=30μl) tot 10fM (≈6.000 kopieën/μl, volume=30μl), wat een meer dan 10.000-voudige verbetering in detectiegevoeligheid aantoont vergeleken met een systeem zonder natriumheparine.
De concentratie van het apenpokkenvirus-template was 10 fM, en Cas12a-crRNA (100 nM) werd gebruikt om de doelgenen f31 en b6r te detecteren. De amplificatiereactie werd beëindigd op 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 en 20 minuten, en het gehalte aan MIRA-amplificatieproduct werd op verschillende tijdstippen geanalyseerd op agarosegels. De resulterende producten werden vervolgens geanalyseerd op agarosegels onder drie verschillende instellingen: MIRA-heparine-natrium zonder Cas12a, MIRA-Cas12a zonder heparine-natrium en MIRA-Cas12a met heparine-natrium. De resultaten toonden aan dat bij afwezigheid van heparine-natrium de nucleïnezuuramplificatie werd belemmerd vanwege de hoge cis--splitsingsactiviteit van Cas12a. De toevoeging van heparine-natrium verhoogde echter de nucleïnezuuramplificatie aanzienlijk als gevolg van de vermindering van de cis--splitsingsactiviteit van Cas12a.
Het artikel laat zien dat een universele detectiemethode voor fluorescerend nucleïnezuur (SURVEY) op basis van natriumheparine kan worden bereikt met behulp van zowel klassieke PAM als suboptimale PAM-sequenties. Daarnaast worden naast LbCas12a ook AsCas12a en AapCas12b veel gebruikt in CRISPR-Dx-methoden. In het systeem dat MIRA-AsCas12a gebruikt, werd fluorescentie alleen waargenomen in de aanwezigheid van 40 µg/ml natriumheparine, wat aangeeft dat het 1fM f31- en b6r-genen kan detecteren. Bij afwezigheid van natriumheparine kan MIRA-AapCas12b 1 f31- en b6r-gen detecteren. Toediening van 20 µg/ml natriumheparine versnelde niet alleen de detectiesnelheid van MIRA-AapCas12b, maar verhoogde ook de fluorescentie-intensiteit. Deze bevindingen geven aan dat de een-eenpotmethode die is ontwikkeld met behulp van de dosering van natriumheparine ook toepasbaar is op andere Cas12-subtypes.
