Op het gebied van de moleculaire diagnostiek wordt de polymerasekettingreactie (PCR) lange tijd beschouwd als de gouden standaard voor de detectie van nucleïnezuren. De afgelopen jaren hebben isothermische amplificatietechnologieën, vertegenwoordigd door recombinase polymerase amplificatie (RPA), steeds meer aandacht gekregen vanwege hun snelheid, eenvoud en geschiktheid voor testen op locatie.
Hoewel zowel PCR als RPA nucleïnezuuramplificatiemethoden zijn, verschillen ze aanzienlijk wat betreft werkingsprincipes, apparatuurvereisten en toepassingsscenario's, waardoor elke technologie geschikt is voor verschillende diagnostische behoeften.
1. Kernprincipes: thermische cycli versus constante- temperatuurversterking
PCR is een biochemisch proces dat in staat is om binnen korte tijd een enkel DNA-molecuul tot miljoenen kopieën te amplificeren. De reactie is gebaseerd op herhaalde thermische cycli en bestaat uit drie hoofdstappen:
1.Denaturatie (90-95 graden) – Dubbel-strengig DNA wordt gescheiden in enkele strengen.
2. Uitgloeien (55-65 graden) – Primers binden aan de doelsequenties.
3. Extensie (72 graden) – DNA-polymerase synthetiseert nieuwe DNA-strengen.
Door deze temperatuur{0}}gecontroleerde cycli wordt het doel-DNA exponentieel en met hoge precisie geamplificeerd. PCR vereist echter complexe thermische cyclische instrumenten en duurt doorgaans 1 à 2 uur.
RPA werkt daarentegen bij een constante temperatuur van 37-42 graden, waardoor snelle nucleïnezuuramplificatie mogelijk is zonder thermische cycli. De technologie is gebaseerd op de gecoördineerde werking van recombinase-eiwitten, enkel-strengige DNA-bindende eiwitten en streng-verdringende DNA-polymerase om zeer specifieke doelamplificatie onder isotherme omstandigheden te bereiken.
Het DNA-polymerase dat bij RPA wordt gebruikt, heeft strengverdringingsactiviteit, maar mist 5' → 3'-exonuclease-activiteit. Tijdens amplificatie strekken buitenste primers zich uit langs de matrijsstreng. Wanneer ze dubbel{4}}strengige gebieden tegenkomen die zijn gesynthetiseerd uit binnenste primers, kan het polymerase de stroomafwaartse streng niet afbreken en in plaats daarvan deze verdringen, waardoor nieuwe amplificatieproducten worden gegenereerd.
De gehele reactie wordt voltooid onder een constante temperatuur, waardoor er geen complexe instrumentatie meer nodig is en echte point-of-care- en praktijkgerichte tests- mogelijk worden gemaakt. Door reverse transcriptase op te nemen, kan RPA ook worden toegepast voor de detectie van RNA-doelwitten.
Amplificatieresultaten kunnen worden geanalyseerd met behulp van meerdere uitleesformaten, waaronder eindpuntdetectie, realtime fluorescentiemonitoring, laterale flowtests, en kunnen verder worden geïntegreerd met CRISPR-Cas-systemen, microfluïdica of de volgende- generatie sequencing (NGS) voor geavanceerde testontwikkeling.
Toepassingsscenario's: laboratoriumprecisie versus snel testen op locatie
PCR is een van de meest waardevolle moleculaire diagnostische technologieën geworden en blijft de gouden standaard voor het testen van nucleïnezuren.
Dankzij de hoge nauwkeurigheid, kosteneffectiviteit en schaalbaarheid wordt PCR veel gebruikt in klinische diagnostiek, gecentraliseerde laboratoria, onderzoeksinstellingen en grootschalige screeningprogramma's-, waar infrastructuur en opgeleid personeel direct beschikbaar zijn.
RPA biedt daarentegen duidelijke voordelen bij snelle diagnostiek ter plaatse-. Met versterking in slechts 20 minuten, minimale apparatuurvereisten en eenvoudige bediening, is RPA bij uitstek geschikt voor.
- Eerstelijnsgezondheidszorg en noodsituaties
- Douane- en grensinspectie
- Veldonderzoek naar dier- en plantenziekten
- Milieu- en voedselveiligheidstesten
In combinatie met draagbare apparaten en laterale flowstrips maakt RPA snelle en betrouwbare moleculaire testen buiten traditionele laboratoria mogelijk.
MIRA (multi-enzym isothermische snelle amplificatie)is de gepatenteerde isothermische versterkingstechnologie van Amp Future. Het behoort tot dezelfde technische familie als RPA en is geïnspireerd op natuurlijke DNA-recombinatie- en reparatiemechanismen, waarbij gebruik wordt gemaakt van meerdere functionele enzymen om snelle nucleïnezuuramplificatie onder constante temperatuur te bereiken.
MIRA maakt gebruik van een gecoördineerd systeem van vijf belangrijke enzymen, waaronder helicase, recombinase, enkel-strengig DNA-bindend eiwit en DNA-polymerase, om het volgende mogelijk te maken:
- Breed bedrijfstemperatuurbereik: 25 graden –45 graden
- Snelle amplificatie: resultaat binnen 20 minuten
- Hoge gevoeligheid en specificiteit
- Verbeterde veiligheid en verminderd besmettingsrisico
MIRA is een nucleïnezuuramplificatietechnologie die speciaal is ontworpen voor echte tests op- locatie en op het -punt- punt van de zorg.
Voortbouwend op het MIRA-platform heeft Amp Future een uitgebreid portfolio van producten voor snelle moleculaire POCT ontwikkeld, waaronder:
Middel voor snelle afgifte van nucleïnezuren:
Amplificeerbaar nucleïnezuur wordt binnen 5 minuten bij kamertemperatuur verkregen; lage remming, waardoor een volledige monsterlading tot 50 μl mogelijk is; transport en opslag op kamertemperatuur, geen lichtbescherming vereist.
Isothermisch nucleïnezuuramplificatiereagens:
Versterking voltooid in 5-20 minuten, snel en efficiënt; verschillende reagensvormen (gelyofiliseerd poeder, gelyofiliseerde microsferen, enz.); verschillende methoden voor de presentatie van resultaten (elektroforese, fluorescentie, teststrips).
Geminiaturiseerde draagbare apparaten:
Digitale isotherme detectoren, testinstrumenten in zakformaat-, gemakkelijk in één hand te houden, uitgerust met een powerbank, bevrijden u van de beperkingen van het laboratorium en brengen nauwkeurige nucleïnezuurtests naar het veld.
Enkele/meerdere teststrips:
Geoptimaliseerd op basis van de MIRA-methodologie voor betere compatibiliteit; gecombineerd met MIRA-technologie, wat het gemak benadrukt.
Volledig geautomatiseerde nucleïnezuuramplificatieanalysator:
Vereist slechts één monsterlaadbewerking voor volledig geautomatiseerde detectie; detectielimiet tot één exemplaar; isotherme versterking en automatische capping verminderen het risico op besmetting.
On-Site Rapid Testing-pakket:
Testen ter plaatse--, altijd en overal, alles in één pakket; voltooit het testen in 30 minuten, nauwkeurig en gevoelig.
Voor meer productinformatie of oplossingen kunt u gerust contact met ons opnemen.