Acute luchtweginfecties zijn veel voorkomende ademhalingsziekten bij kinderen, vaak veroorzaakt door virussen. Respiratoir syncytieel virus (RSV) en ademhalingsadenovirus (ADV) zijn twee veel voorkomende pathogenen die acute luchtweginfecties bij kinderen veroorzaken. Milde gevallen kunnen veelkele koude symptomen veroorzaken, zoals hoest en loopneus, terwijl ernstige gevallen ernstige complicaties kunnen veroorzaken, zoals longontsteking en otitis media. Volgens de aanbevelingen van de Wereldgezondheidsorganisatie moet de detectie van pathogenen snel, nauwkeurig, gevoelig en specifiek zijn en niet moeten vertrouwen op gespecialiseerde technici of grote instrumenten. Daarom is het met name belangrijk om een detectiemethode voor RSV en ADV te ontwikkelen die aan de bovenstaande detectievereisten kan voldoen.
De onderzoeksgroep van directeur Ma Dongli van het Institute of Pediatrics van Shenzhen Children's Hospital publiceerde een artikel "A Multiplex Recombinase Polymerase Amplification Assay gecombineerd met CRISPR/ CAS12A voor de detectie van respiratoire syncytial virus en ademhalingsadenovirus" in het Journal "Wetenschappelijke rapporten", met een impactfactor van 4,6.
Onderzoeksoverzicht
Het multi-enzym isotherme snelle nucleïnezuuramplificatietechnologie MIRA wordt gecombineerd met het CRISPR/CAS-detectiesysteem. Door MiRA -primers en CRISPR RNA's (CRRNA's) te ontwerpen, meerdere sequentievergelijkingen uit te voeren, reactieomstandigheden te optimaliseren en fluorescentie -numerieke detectieapparaten te gebruiken om gevoeligheid en specificiteit te verifiëren.
En met behulp van de qPCR -resultaten als vergelijkingscontrole werd de consistentie van de testresultaten van 160 klinische keelstaafmonsters bestudeerd.
Experimentele resultaten
1. Gevoeligheid en specificiteit van Mira-Crispr/CAS12A-detectiemethode
In de MIRA-methode-detectie wordt het RSV-F1/R1-primerpaar gebruikt om nucleïnezuren te amplificeren van keelstaafjes van RSV, ADV, PIV, RHV, MP, CP, Flub, HMPV, FluA of RSV/ADV-geco-geïnfecteerde patiënten. Met uitzondering van RSV en ADV, die geamplificeerde banden hadden, waren de andere resultaten negatief, wat aangeeft dat de geselecteerde MiRA-primers niet kruisreactie waren met de andere acht geteste pathogenen en goed geconserveerd waren.
Vervolgens werden de RSV- en ADV -recombinante plasmiden 10 keer verdund met behulp van steriel water, en de detectielimieten voor RSV en ADV waren beide 106kopieën/ml.
(1-10: keelstaafjesmonsters van patiënten met respectievelijk RSV, RSV/ADV co-infectie en andere monsters voor ademhalingspathogeen))
2. Vergelijk met qPCR
Vergeleken met de qPCR -methode zijn de detectielimieten van RSV en ADV beide 103 kopieën/ml
(Gevoeligheid van qPCR -detectie van RSV en ADV)
De MIRA-CRISPR-methode is meer geschikt voor laboratoria van de basis, met korte detectietijd, eenvoudige werking en geen grootschalige qPCR-instrumenten nodig om experimentele bewerkingen te voltooien.
3. Vergelijking van klinische monsters
Keelstaafjesstaafjes werden verzameld van 160 kinderen met acute luchtweginfecties. Tegelijkertijd werden de MiRA-CRISPR-methode en qPCR-methode gebruikt voor detectie en de resultaten werden vergeleken met de resultaten van klinische proeven.
Vergeleken met de qPCR-methode was de gevoeligheid van de MiRA-CRISPR-methode voor RSV en ADV respectievelijk 98,1% en 91,4% en de detectiespecificiteit was 1 0 0%. De kappa -waarde is groter dan 0,95, wat duidt op een hoge mate van consistentie.
De MIRA-CRISPR-methode heeft de voordelen van snelle, gevoelige en specifieke detectie van RSV en Adv. Het kan virale infecties onmiddellijk en nauwkeurig detecteren en is meer geschikt voor gebruik in gebieden met schaarse medische middelen.